通过移植瘤动物实验探讨奥希替尼AZD9291联合抗VEGF单克隆抗体靶向药物贝伐珠单抗的疗效及作用机制，为进一步临床试验提供理论依据。方法：构建EGFR T790M突变的H1975人肺腺癌细胞移植瘤动物模型。实验分组：低剂量奥希替尼组、高剂量奥希替尼组、低剂量奥希替尼联合贝伐珠单抗组、高剂量奥希替尼联合贝伐珠单抗组。
肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤，其中85%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）［1］。化疗联合抗血管生成靶向药物可显著延长非鳞型NSCLC患者总生存期（overall survival，OS）［2-5］。近年来，个体化分子靶向治疗取得了巨大成功。对于EGFR敏感突变的NSCLC（外显子19缺失［E19 del］和外显子21点突变［E21 L858R］），采用第一代或第二代EGFR-TKIs治疗，相比于传统化疗可明显改善患者的预后。
有研究提示，EGFR-TKIs 获得性耐药后肿瘤VEGF水平会升高，提出耐药后肿瘤细胞对EGFR信号通路的依赖性会降低，而对VEGF 通路的依赖提高［10］。本研究显示，EGFR信号通路依然是T790M耐药突变肺癌细胞重要的生长依赖信号通路，奥希替尼对EGFR 及其下游PI3K/AKT/mTOR 和Ras-Raf-MAPK信号通路均有抑制作用，联合贝伐珠单抗改善了肿瘤组织内的微环境，增强了这两条信号通路的抑制作用，从而更有效地杀伤肿瘤细胞。
EGFR与VEGF相关信号通路均在肿瘤发生发展过程中发挥至关重要的作用。EGFR的异常激活导致肿瘤增殖加速且不受调控，VEGF信号通路与肿瘤血管生成相关。Folkman等［11］提出肿瘤血管生成依赖于激活“血管生成开关”，VEGFA是VEGF最常见的亚型，与VEGFR1，VEGFR2，NRPs（神经素）结合后，触发并激活下游信号通路，促进血管内皮增殖与迁移。VEGF也可引起微血管通透性升高，还可使循环内皮细胞前体、相关免疫细胞和间充质细胞聚集，在构建肿瘤微环境中发挥重要作用。Lichtenberger等［12］研究显示，EGFR通路与VEGF通路存在“cross⁃talk”效应，两者具有协同促进肿瘤生长的作用。本研究观察到，随着奥希替尼给药剂量的增加，药物抑瘤效果增强，而联合VEGF抗体后，奥希替尼抑瘤作用也会增强。而从肿瘤生长曲线可以观察到，贝伐珠单抗协同抑瘤作用较单药剂量加倍抑瘤作用更显著。提示适当剂量的奥希替尼联合抗血管治疗或许比单纯增加奥希替尼剂量能带来更大获益。另一方面，这种联合作用可以降低因为单一增加药物剂量所造成的剂量限制性毒性，当然联合贝伐珠单抗也会引起高血压和出血等风险的增加。在实验中，两联合组各有1只小鼠死亡。需要注意的是，与低剂量奥希替尼组小鼠在实验后期因为肿瘤负荷大所导致的死亡不同，联合组小鼠死亡发生在贝伐珠单抗给药后第3 d，不能确定是由于药物本身引起还是由于实验操作所导致。
本实验中还观察到，奥希替尼AZD9291联合贝伐珠单抗组VEGF表达与微血管密度较奥希替尼单药组减少，但奥希替尼联合贝伐珠单抗组并未因为微血管密度降低而高表达HIF-1α。研究表明，HIF-1α能够增强肿瘤细胞上皮间质转化作用，重构细胞外基质，诱导耐药，而且能够增强肿瘤干细胞活性，协助肿瘤细胞免疫逃逸的产生。本研究认为虽然贝伐珠单抗抑制了肿瘤新生血管生成，但却改善了肿瘤内环境，进而改善了肿瘤组织内的供氧。这也符合Jain等提出的在抗血管生成治疗中出现的血管正常化现象：在1周以内，抗血管生成治疗能使迂曲变形的血管变得更加正常，组织含氧量增加。但治疗持续2.5周，远超血管正常化的时间窗。Foster 等认为，HIF-1αmRNA与蛋白合成并不仅仅依赖于氧，很大程度上依赖PI3K和MAPK通路。而高剂量奥希替尼组和奥希替尼联合贝伐珠单抗治疗组PI3K和MAPK信号通路被抑制，所以HIF-1α表达下降是可以解释的。
观察到奥希替尼AZD9291作用后能够降低下游活化的p-EGFR表达，影响PI3K/AKT/mTOR和Ras-Raf-MAPK双信号通路。这与既往Cross等［15］在体内外实验中对单药奥希替尼作用机制的研究发现相一致。联合贝伐珠单抗加强了这2条信号通路的抑制作用，这也从分子机制上解释了联合治疗为什么能够带来更多的肿瘤缩小。
综上所述，本研究通过移植瘤动物实验证实，第3代EGFR-TKI奥希替尼AZD9291对伴EGFR T790M突变的肺腺癌移植瘤具有很强的抑瘤作用，而贝伐珠单抗能够显著增加奥希替尼对伴EGFR T790M突变的肺腺癌移植瘤的杀伤能力，两者具有协同作用。贝伐珠单抗与奥希替尼协同作用是通过降低肿瘤中VEGF表达，改善肿瘤微环境，增强抑制EGFR下游信号通路激活而实现的。本研究为进一步临床试验提供理论依据。
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